Javascript on tällä hetkellä poissa käytöstä selaimessasi.Kun javascript on poistettu käytöstä, jotkin tämän sivuston toiminnot eivät toimi.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Tiedelaitos, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Katalonia, Espanja * Näillä kirjoittajilla on näkemyksiä tästä työstä Equal tausta: Hyaluronihappo (HA) on luonnossa esiintyvä polysakkaridi, jota käytetään ihon täyteaineiden valmistuksessa esteettisiin tarkoituksiin.Koska sen puoliintumisaika ihmiskudoksissa on useita päiviä, HA-pohjaiset ihotäyteaineet on muunnettu kemiallisesti pidentämään niiden elinikää kehossa.Yleisin muunnelma kaupallisissa HA-pohjaisissa täyteaineissa on 1,4-butaanidiolidiglysidyylieetterin (BDDE) käyttö silloitusaineena HA-ketjujen silloittamiseksi.Jäännös tai reagoimaton BDDE katsotaan myrkyttömäksi alle 2 miljoonasosaa (ppm);Tästä syystä lopullisessa ihon täyteaineessa jäljellä oleva BDDE on mitattava potilasturvallisuuden varmistamiseksi.Materiaalit ja menetelmät: Tämä tutkimus kuvaa BDDE:n ja HA:n välisen silloitusreaktion sivutuotteen havaitsemista ja karakterisointia alkalisissa olosuhteissa yhdistämällä nestekromatografia ja massaspektrometria (LC-MS).Tulokset: Erilaisten analyysien jälkeen havaittiin, että emäksiset olosuhteet ja korkea lämpötila, joita käytettiin HA-BDDE-hydrogeelin desinfiointiin, edistivät tämän uuden sivutuotteen, "propyleeniglykolin kaltaisen" yhdisteen muodostumista.LC-MS-analyysi vahvisti, että sivutuotteella on sama monoisotooppinen massa kuin BDDE:llä, erilainen retentioaika (tR) ja erilainen UV-absorbanssi (λ=200 nm).Toisin kuin BDDE:ssä, LC-MS-analyysissä havaittiin, että samoissa mittausolosuhteissa tällä sivutuotteella on suurempi havaitsemisnopeus 200 nm:ssä.Johtopäätös: Nämä tulokset osoittavat, että tämän uuden yhdisteen rakenteessa ei ole epoksidia.Keskustelu on avoin tämän uuden sivutuotteen riskin arvioimiseksi kaupallisiin tarkoituksiin HA-BDDE-hydrogeelin (HA-ihon täyteaineen) tuotannossa.Avainsanat: hyaluronihappo, HA-ihon täyteaine, silloitettu hyaluronihappo, BDDE, LC-MS-analyysi, BDDE-sivutuote.
Hyaluronihappoon (HA) perustuvat täyteaineet ovat yleisimpiä ja suosituimpia kosmeettisissa tarkoituksiin käytettyjä ihon täyteaineita.1 Tämä ihon täyteaine on hydrogeeli, joka koostuu yleensä >95 % vedestä ja 0,5-3 % HA:sta, mikä antaa niille geelimäisen rakenteen.2 HA on polysakkaridi ja selkärankaisten solunulkoisen matriisin pääkomponentti.Yksi ainesosista.Se koostuu (1,4)-glukuronihappo-β (1,3)-N-asetyyliglukosamiinista (GlcNAc) toistuvista disakkaridiyksiköistä, jotka on yhdistetty glykosidisilla sidoksilla.Tämä disakkaridikuvio on sama kaikissa organismeissa.Verrattuna joihinkin proteiinipohjaisiin täyteaineisiin (kuten kollageeniin), tämä ominaisuus tekee HA:sta erittäin bioyhteensopivan molekyylin.Näillä täyteaineilla voi olla aminohapposekvenssispesifisyyttä, jonka potilaan immuunijärjestelmä voi tunnistaa.
Ihon täyteaineena käytettynä HA:n päärajoitus on sen nopea vaihtuminen kudoksissa, koska läsnä on tietty entsyymiperhe, jota kutsutaan hyaluronidaaseiksi.Tähän mennessä on kuvattu useita kemiallisia modifikaatioita HA-rakenteessa pidentävän HA:n puoliintumisaikaa kudoksissa.3 Suurin osa näistä modifikaatioista yrittää vähentää hyaluronidaasin pääsyä polysakkaridipolymeereihin silloittamalla HA-ketjuja.Siksi siltojen muodostumisen ja molekyylien välisten kovalenttisten sidosten muodostumisen vuoksi HA-rakenteen ja silloitusaineen välillä silloitettu HA-hydrogeeli tuottaa enemmän antientsyymien hajoamistuotteita kuin luonnollinen HA.4-6
Tähän mennessä silloitetun HA:n valmistukseen käytettyjä kemiallisia silloitusaineita ovat metakryyliamidi, 7-hydratsidi, 8-karbodi-imidi, 9-divinyylisulfoni, 1,4-butaanidiolidiglysidyylieetteri (BDDE) ja poly(etyleeniglykoli)diglysidyylieetteri.10,11 BDDE on tällä hetkellä yleisimmin käytetty silloitusaine.Vaikka tämän tyyppiset hydrogeelit on todistettu turvallisiksi vuosikymmeniä, käytetyt silloitusaineet ovat reaktiivisia reagensseja, jotka voivat olla sytotoksisia ja joissakin tapauksissa mutageenisia.12 Siksi niiden jäännöspitoisuuden lopullisessa hydrogeelissä on oltava korkea.BDDE:tä pidetään turvallisena, kun jäännöspitoisuus on alle 2 miljoonasosaa (ppm).4
On olemassa useita menetelmiä vähäjäännöksen BDDE-pitoisuuden, silloitusasteen ja substituutioaseman havaitsemiseksi HA-hydrogeeleissä, kuten kaasukromatografia, kokoekskluusiokromatografia yhdistettynä massaspektrometriaan (MS), ydinmagneettisen resonanssin (NMR) fluoresenssin mittausmenetelmät ja Diodirivikytkentäinen korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC).13-17 Tämä tutkimus kuvaa sivutuotteen havaitsemista ja karakterisointia lopullisessa silloitetussa HA-hydrogeelissä, joka on tuotettu BDDE:n ja HA:n reaktiolla alkalisissa olosuhteissa.HPLC ja nestekromatografia-massaspektrometria (LC-MS-analyysi).Koska tämän BDDE:n sivutuotteen myrkyllisyyttä ei tunneta, suosittelemme, että sen jäämien määrä määritetään samalla tavalla kuin lopputuotteen BDDE:lle tavallisesti suoritettavalla menetelmällä.
Saadun HA:n natriumsuolan (Shiseido Co., Ltd., Tokio, Japani) molekyylipaino on ~1 368 000 Da (Laurentin menetelmä)18 ja rajaviskositeetti 2,20 m3/kg.Silloitusreaktiota varten BDDE (≥ 95 %) ostettiin Sigma-Aldrich Co.:lta (St. Louis, MO, USA).Fosfaattipuskuroitu suolaliuos, jonka pH oli 7,4, ostettiin Sigma-Aldrich Companylta.Kaikki LC-MS-analyysissä käytetyt liuottimet, asetonitriili ja vesi ostettiin HPLC-laadusta.Muurahaishappo (98 %) ostetaan reagenssilaatuna.
Kaikki kokeet suoritettiin UPLC Acquity -järjestelmällä (Waters, Milford, MA, USA) ja liitettiin API 3000 kolminkertaisen kvadrupolin massaspektrometriin, joka oli varustettu sähkösumutusionisaatiolähteellä (AB SCIEX, Framingham, MA, USA).
Silloitettujen HA-hydrogeelien synteesi aloitettiin lisäämällä 198 mg BDDE:tä 10-prosenttiseen (w/w) natriumhyaluronaattiliuokseen (NaHA) 1-prosenttisen alkalin (natriumhydroksidi, NaOH) läsnä ollessa.Lopullinen BDDE-pitoisuus reaktioseoksessa oli 9,9 mg/ml (0,049 mM).Sitten reaktioseos sekoitettiin perusteellisesti ja homogenisoitiin ja annettiin edetä 45 °C:ssa 4 tuntia.19 Reaktion pH pidetään -12:ssa.
Sen jälkeen reaktioseos pestiin vedellä ja lopullinen HA-BDDE-hydrogeeli suodatettiin ja laimennettiin PBS-puskurilla, jotta saavutettiin HA-pitoisuus 10 - 25 mg/ml ja lopullinen pH 7,4.Valmistettujen silloitettujen HA-hydrogeelien steriloimiseksi kaikki nämä hydrogeelit autoklavoidaan (120 °C 20 minuuttia).Puhdistettua BDDE-HA-hydrogeeliä säilytetään 4 °C:ssa analyysiin asti.
Silloitetussa HA-tuotteessa olevan BDDE:n analysoimiseksi punnittiin 240 mg:n näyte ja se vietiin keskireikään (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; tilavuus 0,5 ml) ja sentrifugoitiin 10 000 rpm:llä huoneenlämpötilassa. 10 minuuttia.Yhteensä 20 ui pull-down nestettä kerättiin ja analysoitiin.
BDDE-standardin (Sigma-Aldrich Co) analysoimiseksi alkalisissa olosuhteissa (1 %, 0,1 % ja 0,01 % NaOH), jos seuraavat ehdot täyttyvät, nestenäyte on 1:10, 1:100 tai enintään 1:1 000 000 Käytä tarvittaessa MilliQ-deionisoitua vettä analysointiin.
Silloitusreaktiossa käytetyille lähtöaineille (HA 2 %, H20, 1 % NaOH ja 0,049 mM BDDE) analysoitiin 1 ml kutakin näistä materiaaleista valmistettua näytettä käyttäen samoja analyysiolosuhteita.
Ionikartassa esiintyvien piikkien spesifisyyden määrittämiseksi lisättiin 10 ui 100 ppb BDDE-standardiliuosta (Sigma-Aldrich Co) 20 ul:n näytteeseen.Tässä tapauksessa standardin lopullinen pitoisuus kussakin näytteessä on 37 ppb.
Valmista ensin BDDE-kantaliuos, jonka pitoisuus on 11 000 mg/L (11 000 ppm), laimentamalla 10 μl standardi-BDDE:tä (Sigma-Aldrich Co) 990 μl:lla MilliQ-vettä (tiheys 1,1 g/ml).Käytä tätä liuosta 110 µg/L (110 ppb) BDDE-liuoksen valmistukseen välistandardilaimennokseksi.Käytä sitten välituotteena olevaa BDDE-standardilaimennusainetta (110 ppb) standardikäyrän valmistelemiseksi laimentamalla välilaimennusainetta useita kertoja, jotta saavutetaan haluttu pitoisuus 75, 50, 25, 10 ja 1 ppb.Kuten kuviossa 1 esitetään, havaitaan, että BDDE-standardikäyrällä 1,1 - 110 ppb on hyvä lineaarisuus (R2>0,99).Standardikäyrä toistettiin neljässä riippumattomassa kokeessa.
Kuva 1 LC-MS-analyysillä saatu BDDE-standardikalibrointikäyrä, jossa havaitaan hyvä korrelaatio (R2>0,99).
Lyhenteet: BDDE, 1,4-butaanidiolidiglysidyylieetteri;LC-MS, nestekromatografia ja massaspektrometria.
Silloitetussa HA:ssa läsnä olevien BDDE-standardien ja perusliuoksen BDDE-standardien tunnistamiseksi ja kvantifioimiseksi käytettiin LC-MS-analyysiä.
Kromatografinen erotus suoritettiin LUNA 2,5 um C18(2)-HST-kolonnilla (50 x 2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) ja pidettiin huoneenlämpötilassa (25 °C) analyysin aikana.Liikkuva faasi koostuu asetonitriilistä (liuotin A) ja vedestä (liuotin B), joka sisältää 0,1 % muurahaishappoa.Liikkuva faasi eluoidaan gradienttieluoimalla.Gradientti on seuraava: 0 minuuttia, 2 % A;1 minuutti, 2 % A;6 minuuttia, 98 % A;7 minuuttia, 98 % A;7,1 minuuttia, 2 % A;10 minuuttia, 2 % A. Ajoaika on 10 minuuttia ja injektiotilavuus on 20 µL.BDDE:n retentioaika on noin 3,48 minuuttia (vaihtelee 3,43 - 4,14 minuuttia kokeiden perusteella).Liikkuva faasi pumpattiin virtausnopeudella 0,25 ml/min LC-MS-analyysiä varten.
BDDE-analyysiä ja MS-kvantifiointia varten UPLC-järjestelmä (Waters) yhdistetään API 3000 kolminkertaisen kvadrupolin massaspektrometriin (AB SCIEX), joka on varustettu sähkösumutusionisaatiolähteellä, ja analyysi suoritetaan positiivisessa ionitilassa (ESI+).
BDDE:llä tehdyn ionifragmenttianalyysin mukaan suurimman intensiteetin omaavan fragmentin määritettiin olevan 129,1 Da:ta vastaava fragmentti (kuvio 6).Siksi moni-ionivalvontamoodissa (MIM) kvantifiointia varten BDDE:n massamuunnos (massa-varaussuhde [m/z]) on 203,3/129,1 Da.Se käyttää myös Full Scan (FS) -tilaa ja Product ion Scan (PIS) -tilaa LC-MS-analyysiin.
Menetelmän spesifisyyden varmistamiseksi analysoitiin nollanäyte (alkuperäinen liikkuva faasi).Nollanäytteessä ei havaittu signaalia, jonka massakonversio oli 203,3/129,1 Da.Mitä tulee kokeen toistettavuuteen, analysoitiin 10 standardiinjektiota 55 ppb (kalibrointikäyrän keskellä), mikä johti jäännösstandardipoikkeamaan (RSD) <5 % (tietoja ei esitetty).
Jäljelle jäänyt BDDE-pitoisuus määritettiin kahdeksassa eri autoklavoidussa BDDE-silloitetussa HA-hydrogeelissä, mikä vastaa neljää riippumatonta koetta.Kuten kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" on kuvattu, kvantifiointi arvioidaan BDDE-standardilaimennoksen regressiokäyrän keskiarvolla, joka vastaa ainutlaatuista huippua, joka havaitaan BDDE-massasiirtymässä 203,3/129,1 Da retentiolla. aika 3,43-4,14 minuuttia Ei odota.Kuvassa 2 on esimerkkikromatogrammi 10 ppb BDDE-vertailustandardista.Taulukossa 1 on yhteenveto kahdeksan eri hydrogeelin BDDE-jäännöspitoisuudesta.Arvoalue on 1 - 2,46 ppb.Siksi näytteen BDDE-jäännöspitoisuus on hyväksyttävä ihmiskäyttöön (<2 ppm).
Kuva 2 Ionikromatogrammi 10 ppb BDDE-vertailustandardista (Sigma-Aldrich Co), MS (m/z) -siirtymä saatu LC-MS-analyysillä 203,30/129,10 Da (positiivisessa MRM-moodissa).
Lyhenteet: BDDE, 1,4-butaanidiolidiglysidyylieetteri;LC-MS, nestekromatografia ja massaspektrometria;MRM, useiden reaktioiden seuranta;MS, massa;m/z, massa/varaussuhde.
Huomautus: Näytteet 1-8 ovat autoklavoituja BDDE-silloitettuja HA-hydrogeelejä.Myös BDDE:n jäännösmäärä hydrogeelissä ja BDDE:n retentioajan huippu on raportoitu.Lopuksi raportoidaan myös uusien piikkien, joilla on erilaiset retentioajat, olemassaolo.
Lyhenteet: BDDE, 1,4-butaanidiolidiglysidyylieetteri;HA, hyaluronihappo;MRM, useiden reaktioiden seuranta;tR, retentioaika;LC-MS, nestekromatografia ja massaspektrometria;RRT, suhteellinen retentioaika.
Yllättäen LC-MS-ionikromatogrammin analyysi osoitti, että kaikkien analysoitujen autoklavoitujen silloitettujen HA-hydrogeelinäytteiden perusteella havaittiin ylimääräinen piikki lyhyemmällä retentioajalla 2,73 - 3,29 minuuttia.Esimerkiksi kuva 3 esittää silloitetun HA-näytteen ionikromatogrammia, jossa ylimääräinen piikki ilmestyy eri retentioajalla, joka on noin 2,71 minuuttia.Havaitun suhteellisen retentioajan (RRT) äskettäin havaitun piikin ja BDDE:n piikin välillä havaittiin olevan 0,79 (taulukko 1).Koska tiedämme, että äskettäin havaittu piikki säilyy vähemmän LC-MS-analyysissä käytetyssä C18-kolonnissa, uusi piikki voi vastata polaarisempaa yhdistettä kuin BDDE.
Kuva 3 LC-MS:llä saadun silloitetun HA-hydrogeelinäytteen ionikromatogrammi (MRM-massakonversio 203,3/129,0 Da).
Lyhenteet: HA, hyaluronihappo;LC-MS, nestekromatografia ja massaspektrometria;MRM, useiden reaktioiden seuranta;RRT, suhteellinen retentioaika;tR, retentioaika.
Sen poissulkemiseksi, että havaitut uudet piikit voisivat olla käytetyissä raaka-aineissa alun perin läsnä olevia kontaminantteja, myös nämä raaka-aineet analysoitiin samalla LC-MS-analyysimenetelmällä.Analysoituja lähtöaineita ovat vesi, 2 % NaHA vedessä, 1 % NaOH vedessä ja BDDE samassa konsentraatiossa, jota käytettiin silloitusreaktiossa.Käytetyn lähtöaineen ionikromatogrammi ei osoittanut yhtään yhdistettä tai piikkiä, ja sen retentioaika vastaa uutta havaittua piikkiä.Tämä tosiasia kumoaa ajatuksen siitä, että lähtöaine ei voi sisältää yhdisteitä tai aineita, jotka voivat häiritä analyysimenettelyä, mutta ei ole merkkejä mahdollisesta ristikontaminaatiosta muiden laboratoriotuotteiden kanssa.BDDE:n ja uusien piikkien LC-MS-analyysin jälkeen saadut pitoisuusarvot on esitetty taulukossa 2 (näytteet 1-4) ja ionikromatogrammi kuvassa 4.
Huomautus: Näytteet 1-4 vastaavat raaka-aineita, joita käytetään autoklavoitujen BDDE-silloitettujen HA-hydrogeelien valmistukseen.Näitä näytteitä ei autoklavoitu.
Lyhenteet: BDDE, 1,4-butaanidiolidiglysidyylieetteri;HA, hyaluronihappo;LC-MS, nestekromatografia ja massaspektrometria;MRM, useiden reaktioiden seuranta.
Kuva 4 vastaa HA:n ja BDDE:n silloitusreaktiossa käytetyn raaka-aineen näytteen LC-MS-kromatogrammia.
Huomautus: Kaikki nämä mitataan samalla pitoisuudella ja suhteella, joita käytetään silloitusreaktion suorittamiseen.Kromatogrammilla analysoitujen raaka-aineiden luvut vastaavat: (1) vettä, (2) 2-prosenttista HA-vesiliuosta, (3) 1-prosenttista NaOH-vesiliuosta.LC-MS-analyysi suoritetaan massakonversiolle 203,30/129,10 Da (positiivisessa MRM-moodissa).
Lyhenteet: BDDE, 1,4-butaanidiolidiglysidyylieetteri;HA, hyaluronihappo;LC-MS, nestekromatografia ja massaspektrometria;MRM, useiden reaktioiden seuranta.
Tutkittiin olosuhteita, jotka johtivat uusien huippujen muodostumiseen.Sen tutkimiseksi, kuinka silloitetun HA-hydrogeelin valmistuksessa käytetyt reaktio-olosuhteet vaikuttavat BDDE-silloitusaineen reaktiivisuuteen, mikä johtaa uusien piikkien (mahdollisten sivutuotteiden) muodostumiseen, suoritettiin erilaisia mittauksia.Näissä määrityksissä tutkimme ja analysoimme lopullista BDDE-silloittajaa, jota käsiteltiin eri pitoisuuksilla NaOH:lla (0 %, 1 %, 0,1 % ja 0,01 %) vesipitoisessa väliaineessa, mitä seurasi autoklavointi tai ilman sitä.Bakteerimenetelmä samojen olosuhteiden simuloimiseksi on sama kuin menetelmä, jota käytetään silloitetun HA-hydrogeelin tuottamiseen.Kuten kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" on kuvattu, näytteen massamuutos analysoitiin LC-MS:llä arvoon 203,30/129,10 Da.BDDE ja uuden piikin konsentraatio lasketaan ja tulokset on esitetty taulukossa 3. Näytteissä, joita ei autoklavoitu, ei havaittu uusia piikkejä riippumatta NaOH:n läsnäolosta liuoksessa (näytteet 1-4, taulukko 3).Autoklavoiduissa näytteissä uusia piikkejä havaitaan vain NaOH:n läsnä ollessa liuoksessa, ja piikin muodostuminen näyttää riippuvan liuoksen NaOH-pitoisuudesta (näytteet 5-8, taulukko 3) (RRT = 0,79).Kuvio 5 esittää esimerkkiä ionikromatogrammista, jossa näkyy kaksi autoklavoitua näytettä NAOH:n läsnä ollessa tai ilman sitä.
Lyhenteet: BDDE, 1,4-butaanidiolidiglysidyylieetteri;LC-MS, nestekromatografia ja massaspektrometria;MRM, useiden reaktioiden seuranta.
Huomautus: Yläkromatogrammi: Näyte käsiteltiin 0,1-prosenttisella NaOH-vesiliuoksella ja autoklavoitiin (120 °C 20 minuuttia).Pohjakromatogrammi: Näytettä ei käsitelty NaOH:lla, vaan se autoklavoitiin samoissa olosuhteissa.Massakonversio 203,30/129,10 Da (positiivisessa MRM-moodissa) analysoitiin LC-MS:llä.
Lyhenteet: BDDE, 1,4-butaanidiolidiglysidyylieetteri;LC-MS, nestekromatografia ja massaspektrometria;MRM, useiden reaktioiden seuranta.
Kaikissa autoklavoiduissa näytteissä, NaOH:n kanssa tai ilman, BDDE-pitoisuus pieneni suuresti (jopa 16,6 kertaa) (näytteet 5-8, taulukko 2).BDDE-pitoisuuden lasku saattaa johtua siitä, että korkeissa lämpötiloissa vesi voi toimia emäksenä (nukleofiilina) avaamaan BDDE:n epoksidirenkaan muodostaen 1,2-dioliyhdisteen.Tämän yhdisteen monoisotooppinen laatu eroaa BDDE:n monoisotooppisesta laadusta, joten se ei vaikuta siihen.LC-MS havaitsi massasiirtymän 203,30/129,10 Da.
Lopuksi nämä kokeet osoittavat, että uusien piikkien syntyminen riippuu BDDE:n, NAOH:n läsnäolosta ja autoklavointiprosessista, mutta sillä ei ole mitään tekemistä HA:n kanssa.
Uusi huippu, joka löydettiin retentioajalla noin 2,71 minuuttia, karakterisoitiin sitten LC-MS:llä.Tätä tarkoitusta varten BDDE:tä (9,9 mg/ml) inkuboitiin 1-prosenttisessa NaOH-vesiliuoksessa ja autoklavoitiin.Taulukossa 4 uuden piikin ominaisuuksia verrataan tunnettuun BDDE-viitehuippuun (retentioaika noin 3,47 minuuttia).Kahden piikin ionifragmentaatioanalyysin perusteella voidaan päätellä, että piikki, jonka retentioaika on 2,72 minuuttia, osoittaa samat fragmentit kuin BDDE-piikki, mutta eri intensiteetillä (kuvio 6).2,72 minuutin retentioaikaa (PIS) vastaavalle huipukselle havaittiin voimakkaampi piikki fragmentoinnin jälkeen massalla 147 Da.Tässä määrityksessä käytetyllä BDDE-pitoisuudella (9,9 mg/ml) havaittiin myös erilaisia absorbanssitiloja (UV, λ = 200 nm) ultraviolettispektrissä kromatografisen erotuksen jälkeen (kuvio 7).Piikki, jonka retentioaika on 2,71 minuuttia, on edelleen näkyvissä 200 nm:ssä, kun taas BDDE-piikkiä ei voida havaita kromatogrammissa samoissa olosuhteissa.
Taulukko 4 Uuden piikin, jonka retentioaika on noin 2,71 minuuttia ja BDDE-piikin, jonka retentioaika on 3,47 minuuttia, karakterisointitulokset
Huomautus: Näiden tulosten saamiseksi kahdelle huipulle suoritettiin LC-MS- ja HPLC-analyysit (MRM ja PIS).HPLC-analyysissä käytetään UV-detektiota aallonpituudella 200 nm.
Lyhenteet: BDDE, 1,4-butaanidiolidiglysidyylieetteri;HPLC, korkean suorituskyvyn nestekromatografia;LC-MS, nestekromatografia ja massaspektrometria;MRM, useiden reaktioiden seuranta;m/z, massa-varaussuhde;PIS, tuote Ionin skannaus;ultraviolettivalo, ultraviolettivalo.
Huomautus: Massafragmentit saadaan LC-MS-analyysillä (PIS).Yläkromatogrammi: BDDE-standardin näytefragmenttien massaspektri.Pohjakromatogrammi: havaitun uuden piikin massaspektri (BDDE-huippuun liittyvä RRT on 0,79).BDDE käsiteltiin 1-prosenttisessa NaOH-liuoksessa ja autoklavoitiin.
Lyhenteet: BDDE, 1,4-butaanidiolidiglysidyylieetteri;LC-MS, nestekromatografia ja massaspektrometria;MRM, useiden reaktioiden seuranta;PIS, tuotteen ioni skannaus;RRT, suhteellinen retentioaika.
Kuvio 7 203,30 Da:n prekursori-ionin ionikromatogrammi ja (A) uusi piikki, jonka retentioaika on 2,71 minuuttia, ja (B) BDDE-vertailustandardin piikin UV-detektio 3,46 minuutin kohdalla 200 nm:ssä.
Kaikissa valmistetuissa silloitetuissa HA-hydrogeeleissä havaittiin, että BDDE:n jäännöskonsentraatio LC-MS-kvantifioinnin jälkeen oli <2 ppm, mutta analyysiin ilmestyi uusi tuntematon huippu.Tämä uusi huippu ei vastaa BDDE-standardituotetta.BDDE-standardituotteelle on myös tehty sama laatumuunnos (MRM-muunnos 203.30/129.10 Da) positiivisessa MRM-tilassa.Yleensä muita analyyttisiä menetelmiä, kuten kromatografiaa, käytetään rajatesteinä BDDE:n havaitsemiseksi hydrogeeleissä, mutta maksimi havaitsemisraja (LOD) on hieman alle 2 ppm.Toisaalta tähän mennessä NMR:ää ja MS:tä on käytetty karakterisoimaan HA:n silloittumisastetta ja/tai modifikaatiota silloitettujen HA-tuotteiden sokeriyksikköfragmenteissa.Näiden tekniikoiden tarkoituksena ei ole koskaan ollut kvantifioida BDDE-jäännösilmaisua niin alhaisilla pitoisuuksilla, joita kuvataan tässä artikkelissa (LC-MS-menetelmämme LOD = 10 ppb).
Postitusaika: 01.09.2021